Biobambooforest

  Competent cell  만들기 전날  Com cell 을  50ml tube 에  30ml  정도   키운다 . (E.coli 랑   똑같이   접종 ) LB 500ml 에   넣어서   다시   키우기  (1h~1:30h) B uffer (CaCl 2 )   만들기 100ml  기준 1M CaCl 2  6ml 100mM PIPES 10ml 50% Glycerol 30ml D. W. 54ml 얼음에   박아   두기 1 시간   키운  competent cell 50ml tube 8~10 개로   나누어   담고  Centrifuge (3000rpm/20min) Supernant  따서   버리고  buffer  로  pellet vortexing ( 즉  washing  단계 )  한  tube 당  2~3ml 50ml tube 에  2 개로   몰아   담아서   얼음  (10min) Centrifuge 3000rpm/10min  후   Supernant   따서   버리고   한  tube 당  buffer 10ml  넣고  pellet  풀어서   섞은   다음  100 λ   씩  EP tube 에   나눠   담기 -80 도에서   보관

세포 동결·해동·계대배양(Subculture) 완벽 가이드: "왜 이렇게 하는지" 원리부터 정리했습니다 세포 배양을 처음 배울 때는 프로토콜을 통째로 외우기 마련입니다. "PBS로 씻고, Trypsin 넣고, 원심분리하고." 순서는 익혔는데 정작 "왜 PBS로 먼저 씻어야 하는지", "왜 얼릴 때는 천천히, 녹일 때는 빨리 해야 하는지"를 물으면 말문이 막히는 경우가 많습니다. 문제는 순서를 안다고 해서 응용이 되지는 않는다는 데 있습니다. 세포 상태가 조금만 달라져도, 예를 들어 confluency가 낮거나 세포가 유난히 접착력이 강한 세포주라면 원리를 모르는 상태에서는 대응이 어렵습니다. 이전 글 DMEM은 왜 그런 이름이 붙었을까: 배지 이름에 숨은 두 과학자 이야기 에서 다뤘던 DMEM은 사실 이번 글의 주인공이기도 합니다. 세포 동결 배지(Freezing Media)의 절반이 바로 DMEM이기 때문입니다. 이번 글에서는 동결(Freezing), 해동(Thawing), 계대배양(Subculture) 세 가지 기본기를 각 단계가 "왜" 필요한지 중심으로 정리하고, 실무에서 자주 나오는 실수까지 짚어보겠습니다. 세포 배양 기본기가 흔들리는 이유: 얼음 결정과 삼투압 동결·해동·계대배양 세 가지는 서로 다른 작업처럼 보이지만, 사실 하나의 원리로 꿰어집니다. 바로 세포막이 급격한 환경 변화에 취약하다 는 점입니다. 세포를 얼릴 때 세포 안팎의 물이 얼음 결정으로 변하면 그 결정이 세포막과 세포 소기관을 물리적으로 찢어버립니다. 이를 막기 위해 DMSO 같은 동결보호제(Cryoprotectant)를 넣고, 냉각 속도를 분당 약 1°C로 천천히 조절하는 것이 표준입니다. 너무 빨리 얼리면 세포 안에 얼음 결정이 그대로 맺히고, 너무 천천히 얼리면 세포 밖의 물만 얼면서 세포 내부의 삼투압이 지나치게 높아져 세포가 탈수됩니다. 그래서 "적당히 천천히...

  L929 Soup  만들기 L929 를  Culture  한   후  100% 로   꽉   채운   뒤   이틀   정도   더   키운다 . 위에  soup  만   걷어내서  Centrifuge 1200rpm 2min  정도   하여   죽은  cell 과   찌꺼기  pellet 을   모은다 . 위에   상층액만  -20 ℃   에서   보관한다 . 사용시   뽑아낸  monocyte 를   깔아줄   때   부피의  10%  비율로   첨가해준다 .

   mice 로부터  monocyte  추출 경추탈골   후   털   날림을   방지하기   위해서   알코올로   충분히   적셔준다 . 뒷다리   근처   복부를  Y 자로   잘라주고   대퇴부와   엉치   뼈   사이 ,  발목을   자른다 . 피부를   벗겨내고   무릎   연골도   잘라준다 .  근육을   제거하고   대퇴골만   사용한다 . 대퇴골   양   끝을   잘라주고  1ml  주사기로   양   쪽을   통과시켜   구멍을   낸다 .  media 로   양쪽   번갈아   가면서  2~3 번씩   뿌린다 . C ell 이   가라앉는   것을   방지하기   위해서  10~20 번  pipetting  해준다 . F iltering  하여   Conical tube 로   이동하여  1200rpm 에서  5min,  상온 4ml ACK Solution 을   넣어주고  tapping 하여   적혈구제거  ( 적색이   사라짐 ) M edia  첨가후  centrifuge 1200rpm, 3min M edia 와  Growth factor  첨가후   Φ 100 dish 에   깔 아준다 . 2 시간   이후   붙으면  wash...