Cell-based Potency Assay를 담당해본 사람이라면 한 번쯤 이런 경험을 합니다. 같은 시료를 월요일, 화요일, 수요일에 나눠 측정했는데 EC50이 매번 다르게 나오는 상황입니다. 시료는 냉동고에서 꺼낸 그대로인데 결과만 흔들립니다. 이때 대부분의 연구원은 "왜 굳이 Reference Standard를 같이 돌려야 하지?"라는 질문에는 답할 수 있어도, "왜 그래야만 하는지"를 논리적으로 설명하는 데는 막힙니다. 이 글은 그 빈틈을 채우기 위한 글입니다.
같은 시료인데 EC50이 매번 다른 이유
다음과 같은 결과를 받았다고 가정해 보겠습니다.
| 실험일 | EC50 |
|---|---|
| 월요일 | 1.2 ng/mL |
| 화요일 | 1.7 ng/mL |
| 수요일 | 1.4 ng/mL |
이 시료의 역가(Potency)가 실제로 요일마다 바뀐 것일까요? 대부분의 경우 그렇지 않습니다. Potency Assay는 일반적인 화학 분석과 달리 살아있는 세포를 반응 매개체로 씁니다. 그래서 아래와 같은 요소 하나하나가 Dose-Response Curve 전체를 좌우로 밀어낼 수 있습니다.
- Cell passage number
- Cell viability
- 배양 시간
- CO&sub2; 농도
- Incubation 시간
- Reagent lot
- Plate coating 상태
- Pipetting 오차
- Plate reader sensitivity
이 목록에서 알 수 있듯, EC50은 시료 자체의 특성뿐 아니라 그날의 실험 환경을 함께 반영하는 값입니다. 바로 이 지점이 Potency Assay를 일반 화학 분석보다 다루기 까다롭게 만드는 근본 원인입니다.
Absolute Potency의 한계
Absolute Potency Assay는 시험 시료의 EC50이나 IC50을 그 자체로 결과값으로 사용하는 방식입니다. 예를 들어 어떤 항체의 EC50이 1.5 ng/mL로 측정됐다면, 그 숫자를 곧 Potency로 보고하는 접근입니다. 직관적이고 계산도 단순해 보입니다.
문제는 다음 날 같은 시료를 다시 측정했을 때 발생합니다. EC50이 2.0 ng/mL로 나왔다면, 이 차이가 시료의 품질 변화 때문인지, Cell 상태 때문인지, 시약 Lot 때문인지, 장비 편차 때문인지를 구분할 방법이 없습니다. Absolute Potency는 실험 변동성을 걸러내지 못한 채 결과에 그대로 섞어 넣기 때문입니다. 그래서 생물학적 분석에서는 Absolute Potency 하나만으로 제품 품질을 판단하기 어렵다는 공감대가 형성되어 있습니다.
그래서 Relative Potency가 등장했다
이 한계를 넘어서기 위해 나온 방법이 Relative Potency Assay입니다. 아이디어는 의외로 단순합니다. 시험품을 혼자 측정하지 말고, 항상 Reference Standard와 함께 측정하자는 것입니다.
같은 Plate 위에서 Reference Standard와 Test Sample을 동시에 시험하면, 두 시료는 동일한 Cell, 동일한 Reagent, 동일한 Operator, 동일한 Incubation 조건을 그대로 공유합니다. 그날 Cell 상태가 조금 나빴다면 Reference Standard도, Test Sample도 똑같이 그 영향을 받습니다. 따라서 절대적인 EC50 값보다 "기준품 대비 얼마나 차이가 나는가"를 계산하는 편이 훨씬 안정적인 지표가 됩니다.
Relative Potency는 어떻게 계산할까
Reference Standard의 EC50이 1.0 ng/mL, 시험품의 EC50이 1.2 ng/mL라고 가정해 보겠습니다. 시험품은 기준품과 동일한 반응을 얻기 위해 약 20% 더 높은 농도가 필요합니다. 즉 시험품의 Potency는 기준품보다 다소 낮다고 해석할 수 있습니다. 반대로 시험품의 EC50이 0.8 ng/mL라면 더 적은 양으로 같은 효과를 내는 셈이므로 Potency가 더 높다고 볼 수 있습니다. 이렇게 Relative Potency는 절대 EC50 값이 아니라, Reference Standard를 1(또는 100%)로 두고 그 대비 상대적인 활성으로 결과를 표현하는 방식입니다.
그런데 왜 Standard Curve까지 필요할까
여기서 흔히 나오는 질문이 있습니다. Reference Standard 농도 하나만 있으면 되지, 왜 여러 농도를 준비해서 Standard Curve 전체를 그릴까요? 이유는 명확합니다. Potency는 단일 농도에서 결정되는 값이 아니기 때문입니다.
생물학적 반응은 대부분 S자 형태(Sigmoid)의 Dose-Response Curve를 따릅니다. 농도 하나만 비교해서는 최대 반응(Emax), 최소 반응(Bottom), 기울기(Hill slope), EC50 중 어느 요소가 달라졌는지 구분할 수 없습니다. 여러 농도로 전체 Curve를 그려야 두 시료의 반응 특성을 온전히 비교할 수 있습니다. Standard Curve는 단순히 농도별 반응을 나열한 그래프가 아니라, Reference Standard의 생물학적 반응을 기준점으로 세우는 과정 그 자체입니다.
Relative Potency를 계산하기 전에 반드시 확인해야 할 것
Reference Standard와 시험품의 Curve를 나란히 겹쳐 놓았다고 곧바로 Relative Potency를 계산할 수 있는 것은 아닙니다. 먼저 두 Curve가 비교 가능한 형태인지 확인하는 절차가 선행되어야 합니다. 대표적으로 아래 항목을 점검합니다.
- 두 Curve가 같은 형태(모델)를 따르는지
- 최대 반응(Emax)이 서로 비슷한지
- 최소 반응(Bottom)이 서로 비슷한지
- 기울기(Hill slope)가 유사한지
- 두 Curve가 서로 평행한지(Parallelism)
이 조건이 충족되어야 비로소 Relative Potency 계산이 의미를 갖습니다. 이 검증 과정을 통계적으로 자동화해주는 프로그램이 PLA(Parallel Line Analysis) Software입니다. Parallelism이 왜 Relative Potency 계산에서 가장 중요한 전제 조건인지는 다음 글에서 더 자세히 다루겠습니다.
USP <1032>와 ICH Q2(R2)는 왜 Relative Potency를 권장할까
이 접근이 개별 실험실의 관행에 그치는 것은 아닙니다. USP 총칙 <1032> "Design and Development of Biological Assays"는 동물, 세포, 장비, 시약은 물론 실험일과 실험실 간 차이에서 비롯되는 생물학적 시험계 고유의 변동성 때문에, 절대적인 Potency보다 Reference Standard 대비 상대적인 활성을 측정하는 방식이 채택되어 왔다고 설명합니다.[1] 이 관점에서 Reference Standard의 Potency는 통상 1(또는 100%)로 고정되고, 시험품은 그 기준에 대한 상대값으로 보고됩니다.[1] 두 Curve의 평행성(Parallelism)을 검증하는 세부 통계 방법은 USP <1034> "Analysis of Biological Assays"에서, Validation 요건은 USP <1033> "Biological Assay Validation"에서 각각 다루고 있습니다.[2][3]
ICH Q2(R2) "Validation of Analytical Procedures"는 2023년 채택되어 화학의약품뿐 아니라 생물의약품 분석법 밸리데이션까지 명시적으로 포괄하도록 개정된 가이드라인입니다.[4] 이 가이드라인은 적절한 경우 Reference Material(기준 물질)을 활용해 분석법 밸리데이션을 수행하도록 요구하며, 서로 다른 실험실에서 측정한 생물학적/생명공학 제품의 Potency를 의미 있게 비교하려면 적절히 관리된 기준 물질이 전제되어야 한다는 점을 명시하고 있습니다.[5]
정리하면 Reference Standard는 단순한 비교 대상이 아닙니다. 실험의 변동성을 보정하고, 결과의 일관성과 실험실 간 비교 가능성을 확보하기 위한 핵심 기준점입니다.
이 글에서 기억해야 할 네 가지
| 핵심 개념 | 한 줄 요약 |
|---|---|
| Absolute Potency | EC50 자체를 결과로 쓰지만 실험 변동성을 그대로 떠안는다 |
| Relative Potency | Reference Standard와 동시에 측정해 변동성을 상쇄한다 |
| Standard Curve | 단일 농도가 아닌 전체 Dose-Response 반응을 기준으로 세운다 |
| Parallelism | 두 Curve가 비교 가능한지 먼저 검증해야 Relative Potency가 성립한다 |
FAQ
Q1. Reference Standard 없이 Potency Assay를 수행하면 안 되나요?
불가능하지는 않지만 권장되지 않습니다. Reference Standard 없이 얻은 Absolute Potency는 그날의 실험 조건 변화를 결과와 분리할 수 없어, 시료 간 비교나 배치 간 품질 추적에 활용하기 어렵습니다.
Q2. Relative Potency 값이 100%보다 높으면 무조건 좋은 것인가요?
반드시 그렇지는 않습니다. Relative Potency는 Reference Standard 대비 활성의 상대값일 뿐이며, 제품 규격(Specification)에서 정한 허용 범위 안에 들어오는지가 판단 기준입니다. 100%보다 높다고 해서 항상 바람직한 것은 아니며, 범위를 벗어나면 그 자체로 조사(Investigation) 대상이 될 수 있습니다.
Q3. Parallelism이 확인되지 않으면 Relative Potency를 아예 계산할 수 없나요?
원칙적으로는 그렇습니다. 두 Curve가 평행하지 않다는 것은 시험품과 Reference Standard가 단순한 농도 차이로 설명되지 않는, 즉 생물학적으로 유사하지 않을 가능성을 시사합니다. 이 경우 Relative Potency 값 자체의 해석이 무의미해지므로, 원인 분석이 선행되어야 합니다.
Q4. Absolute Potency는 아예 쓸모가 없는 개념인가요?
그렇지는 않습니다. 초기 Assay 개발 단계에서 반응 범위나 감도를 확인할 때는 Absolute Potency 값도 참고 자료로 쓰입니다. 다만 배치 출하 판정이나 안정성 평가처럼 결과의 재현성이 중요한 상황에서는 Relative Potency가 표준으로 자리 잡았습니다.
참고문헌
- USP General Chapter <1032> "Design and Development of Biological Assays" — 생물학적 시험계의 변동성과 Relative Potency 방법론 채택 배경.
- USP General Chapter <1034> "Analysis of Biological Assays" — Parallelism 통계 분석 방법.
- USP General Chapter <1033> "Biological Assay Validation" — Bioassay Validation 요건.
- ICH Q2(R2) "Validation of Analytical Procedures" (2023년 채택) — 생물의약품 분석법 밸리데이션 범위 확대.
- ICH Q2(R2)/Q14 Training Material — Reference Material 활용 및 실험실 간 Potency 비교 가능성에 관한 서술.
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